核酸提取那些事儿

2018-04-08 14:38:58 发布者:xinxinpink 来源:吉玛基因 浏览次数:0

最近有篇报道“Nucleic acid purification from plants,animals and microbes in  under 30 seconds”即利用试纸条30秒内纯化动物、植物和微生物的核酸,发表在PLoS  Biology期刊上,引起热议,故对现核酸提取扩增尽己所能

最近有篇报道“Nucleic acid purification from plants,animals and microbes in under 30 seconds”即利用试纸条30秒内纯化动物、植物和微生物的核酸,发表在PLoS Biology期刊上,引起热议,故对现核酸提取扩增尽己所能进行总结。

 

核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点与相似的理化特性。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离核酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L,DNA钠盐在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。

 

 

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核酸提取前提需进行核酸裂解释放,经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸,也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的。

 

在细菌、植物等富含多糖样品的基因组抽提中,裂解液中常含 CTAB ,CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响,洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些,同时,CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响,所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键;质粒抽离一般采用SDS 碱裂解法;高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法,替代传统抽提 RNA 的首选方法,传统的trizol结合氯仿,对人体损伤较大,渐渐被弃用。

 

 

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PCR 模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法,正如文献报道:将叶子组织浸入到含有500μl细胞裂解液(20 mMTris [pH 8.0], 25 mMNaCl, 2.5 mM EDTA,0.05% SDS)和两个滚珠的试管中。再把试纸条浸入到叶子组织的粗提液中来结合核酸,随后又让它浸入到清洗液中(10 mMTris [pH 8.0], 0.1% Tween-20),最后将它浸入到扩增反应液中,从而结合到它上的核酸洗脱下来,并将扩增反应液转移到一台热循环仪中进行扩增反应。该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR,非常快速。同时由于不纯化,往往含有大量抑制 PCR 的物质,比如牛奶中含有较多乳铁蛋白,全血 ( 或血清、血浆 ) 中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素,土壤中含有较多腐殖酸等。这些物质会强烈抑制 DNA 聚合酶的活性,使 PCR 失效,导至假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。为了提高检出率需要加入高耐受 DNA 聚合酶(AlphaTaq)及多种PCR增强剂。该方法最简单的就是反复冻融法,简便快捷,不需任何化学试剂,冻融离心,PCR检测就可以了。如果使用裂解法,哪么最简单的裂解液就是水,复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应,而且能提高裂解效率,甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西,如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单,多使用温度的变化来实现样品的裂解,如煮沸、或者高温-低温的多次循环等,能大大减少操作步骤,大幅度提高检测速度,节省成本。

 

关键词:核酸事儿

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